Обратная связь

ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЙОДИРОВАННЫХ БЕЛКОВ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ЙОДДЕФИЦИТНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

THE STUDY OF PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES OF IODINATED PROTEINS FOR IODINE DEFICIENCY PROPHYLAXIS
Г.Ф. Жукова1, С.А. Савчик2, С.Л. Люблинский2
G.F. Zhukova1, S.A. Savchik2, S.L. Lubninskiy2

1ГУ НИИ Питания РАМН, Устьинский пр., д. 2/14, Москва, 109240, Россия.
2ООО «НПФ Техновита», ул. Ленина, 73, Боровск, Калужская обл., 249010, Россия.

1Institute of Nutrition RAMS, Ust, insky Proezd Str. 2/14, Moscow, 109240, Russia.
2OOO «SPF Technovita», Lenina Str. 73, Borovsk, Kaluga Region, 249010, Russia.

ЖУРНАЛ: Вопросы питания, 2005 г.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: йод, свойства йодированных белков

Йод относится к числу незаменимых микроэлементов, необходимых для нормального роста и развития человека. Суточная потребность в нем составляет 100-200 мкг. Недостаточное потребление йода приводит к йоддефицитным заболеваниям (ЙДЗ), которые обусловлены нарушением синтеза тиреоидных гормонов — регуляторов практически всех биохимических процессов в организме. По данным ВОЗ, около 2 млрд жителей Земли существуют в условиях йодного дефицита (ЙД) | 29, 30]. Исследования, проведенные Эндокринологическим научным центром РАМН, показали, что в последние годы у жителей практически всех территорий России обнаруживается та или иная степень йодного дефицита. Потребление йода при этом составляет 40-80 мкг/сут, что в 2-3 раза меньше необходимого [9, 23].

Общепризнанно, что ЙДЗ могут быть предотвращены при нормализации потребления йода, который поступает в организм человека в основном с пищей [6, 7] - как в виде неорганических соединений (йодаты и йодиды), так и в органической форме (йодированные аминокислоты и белки) [ 11, 24].

Для ликвидации йодной недостаточности существует два подхода: йодирование пищевой поваренной соли путем внесения в нее йодидов или йодатов калия [2, 5, 9], а также использование в рационе питания йодированных белков молока как наиболее близких к веществам природного происхождения по структуре и свойствам (11, 24 ]. С этой целью в ООО «НПФ Техновита» разработана приоритетная технология производства йодированных белков молока [10,12-14].

Материал и методы

В качестве объектов исследования использованы: опытный образец — йодированный белок молока «Биойод» (ООО «НПФ Техновита») [10] и исходный нейодированный молочный белок (контрольный образец).

Йодированные производные: MIT - монойод-тирозин, DIT - дийод-тирозин, LevTyr - левотироксин получены от фирмы «Sigma Chemical С°» (США), фермент проназа (pronase type XIV) - от фирмы «DakoCytomation» (Дания); остальные химикаты и реагенты - «аналитически чистые». Инкубацию белков с проназой при 37° С проводили на термостате 5320 («Eppendorf», Германия). Хроматографическое разделение белков осуществляли на приборе Breeze («Waters», США). Для разделения йодированных аминокислот использовали колонку Jupiter C18 («Phenomenex», США), для разделения белков — колонки Superdex 70 («Amersham Biosciences») и Delta-pak C4 («Waters»). Для лиофилизации исследуемых образцов использовали лиофильную сушилку Alpha 2-4 («Christ», Германия).

Гидролиз белков. Для проведения гидролиза белки растворяли в 0,1 М Трис-HCl буфере (рН 8,0) до концентрации 2 мг/мл, добавляли проназу в количестве 1/10 от массы белка и инкубировали 16ч при 37° С. Гидролизат центрифугировали 15 мин при 10 000 об/мин для осаждения нерастворимых продуктов и анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Разделение йодированных аминокислот. Смеси, полученные в результате гидролиза, разделяли на колонке Jupiter С18. Разделение проводили в градиенте концентрации ацетонитрила [19] в воде, в присутствии 1% уксусной кислоты. Детектирование осуществляли при длинах волн 254 и 280 нм.

Разделение белков. Разделение белков проводили в 2 стадии. Сначала их подвергали гель-фильтрации на колонке Superdex 70, уравновешенной 50 мМ Трис-НСI (рН 7,5), содержащим 0,1 М KCl и 10 мМ ЕДТА. Полученные фракции лиофилизовали и подвергали дальнейшему фракционированию на колонке Delta-pack С4 в градиенте концентрации ацетонитрила в воде (в присутствии 0,1% трифторуксусной кислоты) от 35 до 50% за 60 мин. Для дальнейшего исследования полученные белковые фракции лиофилизовали и проводили MALDI (matrix assisted laser desorption ionization) масс-спектрометрию. Съемку масс-спектров осуществляли на масс-спектрометре REFLEX III («Bruker Daltonics», Германия). В качестве матрицы использовали 2,5-диоксибензойную кислоту. Регистрировали положительные ионы с использованием линейного анализатора. В качестве внешнего стандарта служил лизоцим яичного белка (14308 Да).

Определение йода. Идентификацию и количественное определение йода в исследуемых образцах молока проводили путем разложения органического вещества при сжигании пробы в электропечи в условиях контролируемой температуры и последующего определения йода (в форме йодида) методом инверсионно-катодной переменнотоковой вольтамперометрии в среде инертного газа при рН 2 по высоте пика электрохимического восстановления с максимумом от -190 до -280 мВ ртутно-йодидной соли в результате ее предварительного электронакопления на поверхности ртутного электрода при постоянном потенциале +10 мВ. Использовали метод внутреннего стандарта в соответствии с МУК 4.1.1187 - 03 [1].

Для анализа йода использовали вольтамперометрический анализатор - полярограф ABC - 1.1 в комплекте с IВМ - РС - совместимым компьютером («Вольта», Санкт-Петербург), а также полупроводниковый гамма - спектрометр LP 4900В, рентгеновский анализатор SBS - 50M («Грин-Стар», Россия) и иономер И -120.1. («НПФ Эконикс», Россия). Ионометрическое определение йода проводили на указанном иономере с применением йодидселективного электрода в буферной системе в соответствии с АОАС Official Method 992.24 [18]. При нейтронно-активационном анализе йода исследуемые образцы (масса 2 - 3 мг) запаивали в полиэтиленовые пакетики, помещали вместе с эталонами йода (10-5 г) в полиэтиленовые ампулы и облучали в горизонтальном канале реактора 30 с, затем измеряли гамма-спектры облученных образцов на полупроводниковом гамма-спектрометре LP 4900B. Количество йода в образце определяли в сравнении с интенсивностью сигналов эталонов. Рентгенорадиометрическпй анализ проведен на рентгеновском анализаторе SBS-50M так же, как и при нейтронно-активационном методе анализа (без предварительной пробоподготовки) путем сравнения с контрольной пробой - эталоном.

Результаты и обсуждение

Результаты содержания йода в йодированном белке «Биойод», полученные разными методами, приведены в таблице.

Йодированные белки в небольших концентрациях присутствуют в обычных пищевых продуктах (молоке и молочных продуктах, рыбе и рыбопродуктах и др.) [24]. Существуют различные способы искусственного получения йодированных белков - химические и ферментативные, при которых происходит в основном замещение водорода в фенольном кольце тирозина на йод с образованием моно- и(или) дийодтпрозиновых производных белков [15, 20, 22].

ООО «НПФ Техновита» разработан промышленный способ получения йодированных белков молока с использованием в качестве йодирующего компонента неорганического йода (йодид, молекулярный йод) и смеси ферментов (лактатпероксидазы, каталазы и др.), иммобилизованных на полупроницаемых мембранах и (или) инертных носителях. После окончания процесса проводится макро- и микрофильтрация с последующей диафильтрацией. Окончательной стадией получения йодированных белков молока явилась очистка их на сефадексе G25 методом эксклюзионной гель-фильтрации, позволяющим полностью отделить высокомолекулярные белковые фракции от низкомолекулярных соединений и особенно от исходных, не связанных с белком йодирующих компонентов (йода и йодидов). В результате гель-фильтрации выделены фракции с молекулярной массой, превышающей 14 кДа. Затем раствор йодированного белка, очищенный от низкомолекулярных фракций, подвергали стерилизующей микрофильтрации и сублимационной сушке (10).

Содержание йода в йодированных молочных белках при исследовании различными методами 

Используемый метод 

Результат, % 

Вольтамперометрический 

Нейтронно-активационный 

Рентгенорадиометрический 

Ионометрический 

2,20 

2,50

2,45 

2,05 

Задачей настоящего исследования было изучение структуры и физико-химических свойств йодирован­ных белков, полученных указанным способом (под­тверждение наличия в препарате «Биойод» йодиро­ванных белков; определение места включения в белок йода и степени йодирования белка).

Такие физико-химические методы, как ЯМР-, ИК-спектроскопия и УФ-спектроскопия, мы не использо­вали в связи с их низкой информативностью при опре­делении наличия йода в белках. Наиболее информа­тивна для этих целей MALDI масс-спектрометрия, позволяющая с высокой точностью определять моле­кулярную массу белков в широком диапазоне (до нескольких сотен кДа) [3, 27]. Разница в массе исходных и йодированных белков позволяет легко вычислить количество включенных в белок атомов йода. Для до­казательства наличия йодированных белков в опыт­ном образце молока последний подвергали фракцио­нированию методами гель-фильтрации и обращенно-фазной хроматографии.

На рис. 1 представлен профиль разделения смеси нейодированных и йодированных молочных белков. Видно, что в состав последних входят белки с молекулярной массой >70 кДа (пик с максимумом поглоще­ния при 15 мин), около 20 кДа (фракция А, максимум поглощения при 22 мин) и около 15 кДа (фракция В, максимум поглощения около 26 мин).

Основываясь на имеющихся данных о белковом составе молока и молекулярных массах составляющих молочных белков [4, 8], можно заключить, что фрак­ция А содержит (β-лактоглобулин с молекулярной мас­сой 18 кДа, а фракция В — α-лактальбумин с молекулярной массой 14 кДа. Эти белки, как нейодирован­ные, так и йодированные, могут быть достаточно лег­ко идентифицированы с помощью MALDI масс-спек­трометрии. Фракции А и В йодированных и нейодированных образцов молока, содержащие белки

Рис. 1. Разделение йодированных (сплош­ная линия) и нейодированных молочных бел­ков (пунктир) методом гель-фильтрации на колонке с Супердексом 70. Стрелки указывают место выхода белков, исполь­зованных для калибровки колонки (бычий сыворо­точный альбумин - 67 кДа и цитохром С - 13 кДа). Фракции А и В использованы для дальнейшего разделения. По оси абсцисс - время, мин (здесь и на рис. 2,4, 5).
 

Рис. 2. Разделение фракций, полученных в результате гель-фильтрации йодированных и нейодированных белков (см. рис. 1), методом обращенно-фазной хроматографии. Отмечена фракция (MS), исследованная методом MALDI масс-спектрометрии. Сплошная линия-фракция В йодированных белков, пунктир - фрак­ция В нейодированных белков, пунктир с точкой-фракция А нейодированных белков.

с молекулярной массой, соответственно, около 20 и 15 кДа подвергали разделению методом обращенно-фазной хроматографии на колонке Delta-pak С4. Профиль разделения представлен на рис. 2. Как видно, во фракции В доминирует пик, элюирующийся между 15 и 25 мин, а во фракции А — пик, элюирующийся между 30 и 40 мин. Для дальнейшего анализа нами использована более гомогенная и более интенсивная фракция, элюирующаяся между 15 и 25 мин. Эту фракцию, отмеченную на рис. 2, собирали, лиофилизовали и анализировали методом MALDI масс-спектрометрии (рис. 3). Спектр нейодированного белка характеризуется наличием доминирующего сигнала, соответствующего белку с молекулярной массой 14 174 Да. Этот белок, очевидно, является α-лактальбумином, расчетная масса которого составляет 14 178 Да. В спектре присутствуют также менее интенсивные сигналы, соответствующие, по-видимому, другим вариантам α-лактальбумина. Йодирование белков молока приводит к существенному изменению масс-спектра полученного белка. Практически полностью отсутствует сигнал, относящийся к немодифицированному α-лактальбумину. При этом появляются сигналы 14340, 14466 и 14595 Да, соответствующие белкам, содержащим соответственно 1, 2 и 3 атома йода в молекуле. Хотя метод масс-спектрометрии не является количественным, тем не менее, основываясь на относительной интенсивности сигналов, можно предположить, что основным продуктом йодирования является белок, в молекуле которого содержится 2 атома йода.

Результаты исследования йодированного образца молока методом масс-спектрометрии свидетельствуют о том, что в его состав входят йодированные белки. Полученные данные позволяют сделать вывод, что в опытном образце молока представлены белки, содержащие от 1 до 3 атомов йода на 1 моль белка. Исходя из этих результатов, расчетный уровень йода в йодированном белке, содержащем 1 атом йода, составляет 0,88%, 2 атома йода - 1,74%, 3 атома йода - 2,59%.

Однако метод масс-спектрометрии позволяет лишь определить общее количество включенных атомов йода и не дает ответа на вопрос, в какие аминокислотные остатки он включился. Следующей задачей исследования было установить наличие в смеси йодированных молочных белков йодированных остатков тирозина [ 15,20,22].

Для определения йодированных аминокислотных остатков в белках существует целый ряд методов, основанных на различиях в свойствах немодифицйрованных и йодированных аминокислот. В частности, некоторые методы основаны на различиях в поведении аминокислот при хроматографии [17,19,21,25,26, 31]. Для воспроизведения методики разделения мы подвергали хроматографии нейодированный тирозин, дийод-тирозин, тироксин, а также смесь, полученную в результате йодирования тирозина хлораминовым методом (рис. 4). Полученные результаты показывают, что йодированные тирозины могут быть надежно обнаружены с использованием обращенно-фазной хроматографии. 

Однако для использования этих методов необходимо получить аминокислоты в свободном состоянии. Поскольку йодированные аминокислоты, в частности йодтирозины, неустойчивы в условиях кислотного гидролиза, наиболее часто применяемого для расщепления белков до индивидуальных аминокислот, необходимо использовать иные методы гидролиза. Наиболее мягким и удобным для этой цели является ферментативный гидролиз [16, 17, 19, 26, 28]. Поэтому для гидролиза йодированного образца молока мы использовали фермент проназу. Параллельно проводили гидролиз нейодированного препарата.

Полученный гидролизат разделяли методом обращенно-фазной ВЭЖХ в соответствии с разработанной ранее методикой [19]. Детектирование элюата осуществляли в УФ-области при 2 длинах волн: 254 и 280 нм.

На рис. 5 приведены профили разделения смесей, полученных в результате гидролиза йодированных и нейодированной молочных белков. Как видно, в гидролизатах йодированных белков присутствуют пики, соответствующие DIT, который отсутствует в нейодированном образце. Использованные условия разделения не позволили строго определить наличие MIT (он элюируется совместно с триптофаном).

Рис. 3. MALDI масс-спектры фракций, полуденных в результате обращенно-фазной хроматографии (см. рис. 2) йодированного (сплошная линия) и нейодированного (пунктир) белка.

Рис. 4. Разделение йодированных амино­кислот методом обращенно-фазной хрома­тографии. Туг - тирозин, MIT - монойод-тирозин, DIT - дийод-тирозин, LevTyr - левотироксин (здесь и на рис. 5).

Рис. 5. Разделение продуктов гидролиза проназой йодированного белка. Пунктирные линии - гидролизаты нейодированно¬го белка.

Однако нали­чие DIT, появляющегося в результате йодирования MIT и немодифицированного тирозина, свидетель­ствует о присутствии в препарате MIT.

Таким образом, опытный йодированный образец молока содержит йодированные остатки тирозина в виде МIТ и DIT, отсутствующие в контрольных (нейо­дированных) препаратах, при этом йодированные ос­татки тирозина входят в состав молочных белков, в частности α-лактоальбумина.

Для установления степени йодирования молочных белков йодированный образец молока был подвергнут межлабораторному исследованию с участком аккредито­ванных испытательных центров; определяли содержа­ние в нем органически связанного йода (см. таблицу).

Практически совпадающие данные межлабораторной апробации, представленные в таблице, свиде­тельствуют о наличии в йодированном образце молока, ковалентно связанного с молочным белком йода в количестве от 2,05 до 2,50%. Это совпадает с расчет­ной концентрацией йода в йодированном белке (0,88-2,59%), полученной при масс-спектрометрическом исследовании.

Из имеющиеся данных об аминокислотном соста­ве белков молока [4, 8] следует, что количество тирозиновых остатков, входящих в отдельные белки моло­ка составляет: для α-казеина - 10, (β-казеина - 4, κ-казеина - 9, (β-лактоглобулина - 4, α-лактоальбумина - 4 аминокислотных остатка и т.д. Однако полученные в настоящем исследовании данные о включении йода в мо­лекулы молочных белков (от 1 до 3 атомов йода в одну молекулу белка) свидетельствуют о частичном йодиро­вании остатков тирозина, что можно объяснить стерическими препятствиями для включения йода в белок и микроокружением остатков тирозина в молекуле белка.

Авторы выражают благодарность доктору хим. наук Ю.Н. Уткину (Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН) за помощь и ценные советы при выполнении и оформлении работы.

 

Литература:

  1. Вольтамперометрическое определение йода в пищевых продуктах. Методические указания. МУК 4.1.1187-03. -М,-2003.-23с.
  2. Герасимов Г.А., Фадеев В.В., Свириденко Н.Ю. и др. Йододефицинтные заболевания в России. Простое решение сложной проблемы. - М: Адамантъ. 2002. - 168с.
  3. Говорун В.М., Арчаков Л.И. // Биохимия. 2002. Т. 67. - С. 1109-1123.
  4. Горбатова К.К. Биохимия молока и молочных продуктов. -М.: Легкая промышленность. -1984. - 344 с.
  5. Дедов И.И., Саириденко Н.Ю. Реализация концепции охраны здоровья населения Российской Федерации на период до 2005 года и области ликвидации заболеваний, связанных с дефицитом йода. - М.: Адамангь. - 2001. - 35 с.
  6. Жукова Г.Ф., Савчик С.А., Хотимченко С.А. // Микроэлементы в медицине. - 2004. -Т. 5. - № 1. - С 1-6.
  7. Жукова Г.Ф., Савчик С.А., Хотимченко С.А. // Там же. - Т. 5. - № 3. - С. 1-12.
  8. Комисаренко С.В. // Вопросы питания - 1983. - № 1. - С. 6-11.
  9. Контроль программы профилактики заболеваний, обусловленных дефицитом йода, nутем всеобщего иодирования соли. МУ 2.3.7.1064.01. - М. - 2001. - 6 с.
  10. Люблинский С.Л., Савчик С.А., Смирнов С.В. Способ получения биологически активной добавки к пище. Пат. на изобретение № 2212155 // Бюлл. изобретений - 2003. - № 26. - С. 5-7.
  11. Люблинский С Л., Савчик С.А., Смирнов С.В. Средство для профилактики йоддефицитных состояний организма. Пат. на изобретение № 2211048 // Бюлл изобретении. - 2003. - № 24. - С.15- 19.
  12. Санитарно-эпидемиологическое заключение на «Белок йодированный молочный порошкообразный «Биойод» № 77.99.02.922.Д.006583.09.03 от 05.09 2003 г - М.: Миннауки и технологий, 2003. - 15 с.
  13. Техническая инструкция на производство белка йодированного молочного порошкообразного «Биойод» (ТИ 55690368-003-03). - М.: Миннауки и технологий, 2003. - 21 с.
  14. Технические условия Белок йодированный молочный порошкообразный «Биойод» (ТУ 9224-003-55690368-03). -М.: Миннауки и технологий. - 2003. - 19 с.
  15. Чард А. Радиоиммунологические методы. - М.: Мир, 1981. - С. 60-68.
  16. Черников М.П., Никольская Г.В., Стан Е.Я. // Биохимия. - 1968. - Т. 32, вып. 6. - С.1122-1127.
  17. Alexander N.A., Nishimoto М. // Clin. Chem. - 1979. - Vol. 25, N 10. - P. 1757-1760.
  18. AOAC Official Method 992.24. Iodide in Ready-To-Freed Milk-Based Infant Formula // Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists Ed. S. Williams. - Arlington, 1995. - Ch. 50. - P. 13.
  19. Baudry N., Mallet В., Lejeune P.J. et al. //J. Endocrinol. 1997. - Vol. 153. - P. 99-104.
  20. Bolton A.E. Radioiodination techniques. - Amsterdam. 1985. - P. 1-88.
  21. Covelli I., Zyl A.Van., Edelhoch H. // Anal. Biochem. - 1971. -Vol. 42. - P. 82-90.
  22. David G.S., Reisfeld R.A. // Biochemistry. - 1974. - Vol. 13. - P. 1014-1021.
  23. Dedov I., Gerasimov G. // Iodine Deficiency Disorders (IDD) in regions of Russia Affected by Chernobyl. First Intern. Conference of the European Commission, Belarus, the Russian Federation and the Ukraine on the radiological consequences of the Chernobyl accident (Minsk,18-22 March, 1996) IOS Press, Amsterdam. - 1996. - P. 813-816.
  24. Dorea J.G. //}. Trace Elem. Med. Biol. - 2002. - Vol. 16. - P. 207-220.
  25. Funacoshi K., Cahnmam H.J. // Anal. Biochem. 1969. - Vol. 27. - P. 150-161.
  26. Jonsen J.M., Doom L., Leeuwen F.X. //J. Chrom. - 1991. - Vol. 566. - P. 471-480.
  27. Lin D., Tabb D.L., YatesJ.R. // Biochim. Biophys. Acta. - 2003. - Vol. 1646. - P. 1-10.
  28. Malan P.G. // Biochem. J. - 1968. - Vol. 109. - P. 787-792.
  29. Venkatesh M.G., Dunn J.T. International Counil for the Control of Iodine Deficiency Disorders. - Wageningen, 1995. - 28 p.
  30. WHO: Global prevalence of iodine deficiency disoders. - Geneva. - 1994.
  31. Wu C., Ling R.C.// Anal. Biochem. - 1970. - Vol. 37. - P. 313-319.
Обратная связь
Биойод © 1999-2022
Разработано Kproject